В 1983-1984 году лаборатория радиобиологии Естественно-научного института при пермском госуниверситете провела исследования действия ряда радиопротекторов на лабораторных мышей, облученных изотопом плутония. Некоторые радиопротекторы позволяли увеличивать выживаемость мышей после облучения на 80%.
Выбор стратегии при подборе радиопротекторов обусловливался выбором наиболее уязвимых при поражении гамма-квантами мишеней, а именно – ядерных молекул ДНК. Было установлено, что специфика электронной структуры радиопротектора, в той или иной мере адекватная электронной структуре ДНК, позволяет выбрать наиболее эффективные протекторы, соответственно, было установлен, что радиопротекторы защищают ДНК от повреждений.
Поскольку в молекуле ДНК человека ежедневно происходит порядка миллиона различных повреждений, не все из которых залечивает клетка и сама ДНК (механизм самореперации), одна из стратегий в геронтологии заключается в защите ядерных ДНК от повреждений.
В 2012 году была снята форма секретности, соответственно, появилась возможность применения радиопротекторов в геронтологии.
В отличие от геропротектора Скулачева, который защищает ДНК митохондрий, используемые радиопротекторы не имеют электрического заряда и не повреждают клетку.
Был найден наиболее эффективный радиопротектор. Он весьма токсичен, его введение в кровь сопряжено со стрессом, поэтому была принята методика принятия двух компонент радиопротектора , которые по предположению в пищеварительном тракте в ходе эндотермической биохимической реакции с малым поглощением тепла образуют найденный радиопротектор.
Ранее один компонент применяли в ходе различных лечебных процедур в сочетании с витамином Е, предлагается же его сочетание с гиповитамином оротовой кислоты в качестве биодобавки.
В ряде клинических испытаний данной биодобавки и пациентов повышался тонус, увеличивалась скорость регенерации поврежденных тканей.
Резюмируем
1. В качестве геропротектора предлагается один из эффективных радиопротекторов.
2. Вместо инъекций предлагается использовать биодобавку, состоящую из компонент радиопротектора.
3. Одна из компонент радиопротектора ранее употреблялась в качестве геропротектора с витамином Е, предлагается ее использовать в сочетании с другим витамином, который является компонентой радиопротектора.
4. Суточная потребность входящего в биодобавку витамина – не более 2 г.
Компонента оказывает анаболическое и регенерирующее действие. Является одним из предшественников пиримидиновых нуклеотидов (урацил, тимин, цитозин), входящих в состав нуклеиновых кислот, которые участвуют в синтезе протеинов, достраивает вторую цепочку ДНК при репликации, способствует устранению повреждений ДНК. Принимает участие в обменных процессах, происходящих в белках и фосфолипидах, в превращениях фолиевой и пантотеновой кислот, в метаболизме цианокобаламина (витамин B12), синтезе аминокислоты метионина.
Помимо этого, вовлекается в следующие процессы: утилизация глюкозы, синтез рибозы, создание и поддержание резервов аденозинтрифосфата, активация сократительных возможностей мышечных тканей, рост и развитие клеток и тканей, в частности мышечной ткани (за счет синтеза рибонуклеиновой кислоты, создание резервов мышечного карнозина. Оказывает стимулирующее влияние на белковый обмен, благотворно влияет на функциональное состояние печени, ускоряет регенерацию печеночных клеток, снижает риск развития ожирения печени, способствует снижению уровня холестерина в крови, а также улучшает сокращение миокарда, благоприятно сказывается на репродуктивной функции и процессах роста, что позволяет использовать её в качестве фармакологического препарата (как анаболик) для лечения многих заболеваний печени, желчевыводящих путей, сердца, сосудов и мышц. Транспортируется из крови в печень, другие органы и ткани.
5. Суточное ограничение другой компоненты радиопротектора – 0,2 г.
Компонента повышает иммунные силы организма для борьбы со злокачественными новообразованиями, ВИЧ (замедляет переход к СПИД), а также способствует омоложению кожи и общему омоложению организма благодаря антиоксидантным свойствам.
Способствуют лечению депрессии, а также очищению организма от тяжелых металлов, благодаря усиленной выработки протеина P, вырабатываемого эндотелием головного мозга, понижению уровня плохого холестерина в крови человека, а также делают стенки сосудов более эластичными. Способствует похудению и понижению уровня холестерина, уменьшает кровяное давление, что способствует лечению гипертонии, улучшает функционирование кишечника, улучшает перистальтику и служит профилактикой запоров.
В ряде клинических испытаний данной биодобавки у пациентов повышался тонус, увеличивалась скорость регенерации поврежденных тканей.
Литература
1. Ихлов Б. Л. О новой стратегии защиты клетки от повреждений (геронтология). Сборник статей VIII международной научно-практической конференции «Высокие технологии, фундаментальные и прикладные исследования в физиологии и медицине», 20-22 мая 2015 года, Санкт-Петербург, Россия, стр. 55-60. ISBN 978-5-7422-4882-8.
2. Ихлов Б. Л. Применение радиопротекторов в геронтологии. Вестник новых медицинских технологий. 2018. Т. 25, №3. С. 2029-2035.
3. Boris. L. Ikhlov, Andrey V. Melnichenko. A New Strategy to Protect the Cell from Damage. Open Access Library Journal. Vol. 10. №6. 2023. ID 1110147
https://www.scirp.org/journal/paperinformation.aspx?paperid=125560
ПОЯСНЕНИЯ К ПРОЕКТУ
Вещества, могущие достоверно замедлить старение человеческого организма, как стохастический процесс, пока отсутствуют. Применение таких препаратов, как рапамицин [1], метформин [2], продлевает жизнь модельных организмов - дрозофилы фруктовой, нематоды, серой крысы, домовой мыши и пр.). Возможно, появятся синтетические аналоги FGF21 (гормона голодания) [3], используют также индралин, амифостин и т.д. Предполагается также наличие генетической программы старения, в виду нестареющих и даже «омолаживающихся», т.е. возвращающихся к предыдущим жизненным циклам, обращающим вспять процесс дифференциации клеток организмов.
Предлагается новая стратегия предохранения от негативных возрастных изменений, направленная на защиту от повреждений ДНК. Эти повреждения могут быть вызваны в том числе свободными радикалами, СР. В рамках т.н. СР-теории старения [4, 5, 6] предполагается, что старение происходит вследствие того, что СР, такие, как гидpоксильный pадикал НО-, Н2О2, синглетный кислоpод О- и супеpоксид О2- повpеждают макpомолекулы - липиды, белки и, главным образом, РНК и ДНК [5, 6, 7]
СР-механизм старения подтверждается экспериментально [8, 9]. Видовая продолжительность жизни прямо коррелирует с содержанием бета-каротина, альфа-токоферола и мочевой кислоты в сыворотке крови. В соответствии с этим из всех групп геропротекторов выбирается группа антиоксидантов.
Например, имеются данные о продлении жизни животных при повышенном содержании в организме природных веществ – гормона дигидроэпиандростерона, витаминов А, C, Е (α-токоферола), янтарной кислоты, карнозина, каротиноидов, пигментов фруктов. Упоминаются также витамины D, K, B5, содержащая селен глутатион-пероксидаза, интерферон. К синтетическим геропротекторам относят фуллерены С60, а также SkQ [10], mitoQ и др.).
Действие антиоксидантов сводится к их реакциям с активными мишенями. Так, витамин С связывает водорастворимые СР, b-каротин - жирорастворимые СР, мелатонин – и те, и другие.
В данной презентации предлагается радикальная модификация СР-теории старения. А именно: выбираются те антиоксиданты, мишенью которых является ДНК, как митохондриальные, так и ядерные.
Направление на защиту ДНК от повреждений выбрано в том числе в связи с тем, что повреждения ДНК в клетке сопоставимы со старением полимерных цепочек (например, в органическом стекле) под воздействием солнечного света. Это альтернативный взгляд на причину старения организма в целом. Такой способ защиты ДНК может стать существенной в антиоксидантной системе витаукта.
Д. Синклэйр и др. исследовали группу генов, сиртуинов. Были выведены мыши без одного из SIRT1. У мышей возникли признаки старения, но при этом уровни всех белков в клетках были нормальными, кроме тех, что кодирует митохондриальная ДНК.
Обнаружено, что на молекулярном уровне ключевую роль в процессе старения играет нарушение координации между геномами ядра клетки и ее митохондрий. Раскоординация начинается с падения уровня соединения никотинамид-аденин-динуклеотида (NAD), который уменьшается с возрастом. Без него белок, который кодируется геном SIRT1, не может контролировать активность одного из транскрипционных факторов (молекул, участвующих в транскрипции генетической информации с ДНК) — HIF. Сиртуины также утрачивают способность регулировать процессы апоптоза. Уровень HIF повышается, и это нарушает нормальную коммуникацию двух геномов. С течением времени из-за этого страдает способность клеток производить энергию, и организм стареет.
Удалось замедлить старение червей при помощи никотинамид-мононуклеотида, молекулы-предшественника NAD, который превращается в клетках в NAD и восстанавливает механизм коммуникации геномов в клетке. Старым мышам 22-месячного возраста делали инъекции в течение недели и обнаружили, что их мышечная ткань стала похожей на ткань 6-месячных грызунов, что соответствует у человека 64-м и 18 годам.
В то же время данная работа не снимает проблемы защиты самих ДНК от повреждений.
В данное время стало возможно знакомство с материалами 1-й и 2-й форм допуска, открылись широкие возможности для использования методов радиобиологии в геронтологии.
Соответственно, для замедления старения организма предлагается использовать те вещества, которые ранее были использованы в качестве протекторов от радиационного поражения ядерных ДНК. При этом для подбора протекторов предлагается использовать те, чьи n-уровни «встраиваются» в середину запрещенной зоны уровней молекулы ДНК.
В других стратегиях также считается, например, что ключевую роль в процессе старения играют митохондрии, которые продуцируют СР. Полагают, что такие старческие заболевания, как диабет или болезнь Альцгеймера, возникают из-за необратимых мутаций в ДНК митохондрий.
Еще одна стратегия связана с защитой клетки, в том числе ДНК, от воздействия СР - путем воздействия на СР (см., напр.,[13]), где в качестве антиоксидантов рассматриваются селен-производные). В рамках данной стратегии внимание так же концентрируется на митохондриях - из-за того что в митохондриях происходят активные окислительные процессы, связанные с метаболизмом, в них постоянно образуются СР, повреждающие клетку, а также ДНК митохондрий. С возрастом накапливаются повреждения и мутации, вызванные этими веществами.
В [13] было, в частности, показано, что применение липофильных катионов для транспортировки биоактивных молекул внутрь митохондрий значительно увеличивает их эффективность [15] Так, MitQ (10-(6-убихинолил) децилтрифенилфосфоний) уже в микромолекулярных концентрациях селективно блокирует окислительные повреждения митохондрий и предотвращает апоптоз, индуцируемый пероксидом [16]). Однако разница между анти- и прооксидантными концентрациями MitQ невелика [17]
Для снижения риска прооксидантной активности было предложено использовать пластохинон вместо убихинона [15]. Синтезированная молекула 10Е (6’пластохинонил) децилтрифенилфосфоний получила название SkQ1. Этот препарат препятствовал, в частности, возрастным нарушениям у аутбредных мышей, увеличивало выживаемость и среднюю продолжительность жизни на 92%. Но при этом – снижал двигательную активность и выносливость. Что естественно при снижении концентрации радикалов кислорода. То есть, в данном случае антиоксиданты действуют как ловушки для СР. При этом сами авторы предупреждают, что чистка митохондрий от СР может привести к перерождению клетки в раковую.
В основу предлагаемого метода положен механизм саморепарации.
Как известно, в ДНК существует система саморепарации. Это, в частности, обобществленная π-система, «распределяющая» возбуждение по всей длине ДНК. Она возникла в ходе эволюции, в отсутствие атмосферы, в условиях жесткого УФ и гамма-излучения. Потому, скажем, ДНК сине-зеленых водорослей сохранила максимальную способность к саморепарации, что позволяет им выживать в ядерном реакторе. В тканях организма человека содержится примерно 0,1 мГ урана на 1 кГ, т.е. медленно действующего радиоактивного яда. Он проникает в организм вместе с водой и пищей. Если бы у ДНК (и у клетки) отсутствовала бы система саморепарации, существование животного мира было бы невозможно (ранее Г. М. Баренбойм полагал, что ДНК защищается исключительно от излучения Вавилова-Черенкова, возникающего в клетках при распаде естественной примеси радиоактивных элементов, на самом деле, как мы предполагаем – от всего спектра распада).
Репарируется большинство повреждений ДНК, но небольшая часть сохраняется. Так, у крыс в каждой клетке ежедневно происходит 105 окислительных повреждений ДНК. Если скорость саморепарации не достигает скорости возникновения повреждений, число спонтанных повреждений ДНК увеличивается [18]. Существует связь между продолжительностью жизни вида и скоростью репарации ДНК после воздействия радиации или высокочастотного ультрафиолета [19].
Радиационная повреждаемость ДНК стволовых клеток кишечного эпителия мышей разных линий и возраста примерно одинакова, однако, скорость репарации этих повреждений с возрастом снижается. Способность диплоидных фибробластов человека к репарации индуцированных y-излучением однонитевых разрывов ДНК достоверно снижается с увеличением возраста донора [20].
Материалы и методы
Для защиты от поражения проникающей радиацией используются различные протекторы. Одним из видов протекторов те, мишенью которых является ДНК. Они призваны залечить поражение именно ДНК от воздействия радиации, донируя электрон ионизированной в результате попадания гамма-кванта ДНК.
В рамках описания воздействия гамма-излучения на ДНК с точки зрения зонной теории макромолекула ДНК представляется как квазипериодический кристалл.
При рассмотрении зонной структуры ДНК обнаружено, что система энергетических уровней образуется вкладом отдельных оснований, причем при взаимодействии оснований каждый уровень размывается, образуя зону. Переходы происходят, в основном, между зонами оснований одного типа. Относительное смещение уровней оснований пренебрежительно мало.
Примерная ширина запрещенной зоны составляет по нашим расчетным данным приблизительно 3,83 эВ, по экспериментальным данным - 4 эВ. Расчеты производились в π-приближении.
При воздействии гамма-излучения после релаксации уровней происходит возбуждение p-электронной системы ДНК. При этом электроны с высшего занятого уровня p-системы переходят на ее низшее незанятое, или происходит ионизация молекулы. После прекращения действия излучения возбуждение мигрирует по ДНК и приводит либо к рекомбинации электронов и дырок, либо к повреждению молекулы.
Роль n-уровней ДНК аналогична роли примесных уровней в полупроводниках, где наибольшее влияние на скорость рекомбинации оказывают глубокие примесные уровни, лежащие вблизи середины запрещенной зоны – между валентной зоной и зоной проводимости кристалла (для металлов эта зона отсутствует). При удалении от середины вероятность перехода (донирования) снижается. В связи с этим можно предположить, что n-уровни необходимы для предохранения от возбуждения p-системы ДНК.
Необходимо отметить, что в свободном состоянии основания ДНК являются неустойчивыми к гамма-излучению. Отсюда также следует, что кооперация электронных оболочек играет главную роль в действии предохранительного механизма.
Методом итерационного РМХ рассчитаны электронные уровни ряда известных имеющих большую радиозащитную активность известных радиопротекторов, мишенью которых является ДНК: тиомочевины, меркамина, этирона и их производных. Оказалось, что энергии их валентных n-уровней, соответствует середине или лежит близко к середине запрещенной зоны p-системы ДНК. Удаление от середины приводит к снижению радиозащитной активности, выход за пределы запрещенной зоны (серин, парафенилендиамин, мочевина и др.) уменьшает активность до нуля.
Итак, наиболее эффективными оказываются именно те протекторы, n-уровни которых «встраиваются» в середину, располагаются ближе к середине запрещенной зоны.
Для подтверждения был взят ряд радиопротекторов, мишенью которых является ДНК.
Протекторы вводили мышам-гибридам линии (СВАхС57В16)F1 массой 13-20 грамм, по 20 мышей в опыте, внутрибрюшным способом за 20 минут до облучения, в 2% крахмальном растворе в эквимолярных дозах 0,1 – 0,25 летальной дозы ЛД16. Облучение производили изотопом Ро-210 (5,3 МэВ, на установке «ИГУР» мощностью 0,8 Гр/мин.), в течение 10 мин.
Максимальную радиозащитную активность обнаружили селеноротовая кислота при ЛД95/30 и тиоротилглицин при ЛД60-70/30. Соотношение эффективной и токсической доз для них – 60-70%.
Расчет с помощью РМХ показал, что их n-уровни наиболее близко из всех перечисленных протекторов располагаются к середине запрещенной зоны ДНК – 2 эВ.
Обсуждение
Ранее предполагалось, что наличие у соединения электронно-донорных свойств является необходимым (хотя и не всегда достаточным) условием осуществления ими радиозащитного действия путем заполнения протектором-донором электронной вакансии, в биологических макромолекулах. При этом считалось, что зная энергию наивысшей заполненной молекулярной орбиты, мы тем самым получаем величину потенциала ионизации, которая может служить мерой электронно-донорной способности молекулы, и радиозащитная активность нарастает с увеличением числа донорных радикалов в молекуле.
Вопрос о механизме сближения протектора с мишенью очевиден: сближение ДНК и протектора имеет статистический (броуновский) характер и обусловливается водородной связью, возможно, с образованием эксимера.
Очевидно также, что модели ДНК, в отличие от полупроводника, где влияние на скорость рекомбинации определяется наибольшей вероятностью перехода (середина зоны), взаимодействие протектора с π-системой ДНК носит существенно неусредненный, квантовый характер.
Результат
Показано, что наибольшим защитным эффектом обладают те соединения, n-уровни которых находятся близко к середине запрещенной зоны системы уровней ДНК.
Показано, что применение радиопротекторов in vivo, на 17 испытуемых, приводит к повышению тонуса и увеличению скорости регенерации тканей.
Заключение
Предлагаемый подход не лишает ДНК ее нормальной жизни под воздействием радикалов: протектор воздействует на саму ДНК, которой грозит повреждение.
В нашем методе не требуются сильные антиоксиданты, которые могли бы снизить активность радикалов кислорода, антиоксиданты с большой разницей с прооксидантами, а нужны те, электронная структура которых является подходящей для оснований ДНК.
В нашем методе не требуются катионы, введение которых само по себе негативно сказывается на клетке. При этом концентрация антиоскиданта-протектора может варьироваться в широком диапазоне.
Кроме того, при применении вышеуказанных геропротекторах-антиоксидантах наблюдаются тяжелые побочные эффекты: увеличение частоты развития аденом островков поджелудочной железы (бета-каротин), усиление канцерогенеза в толстой кишке (витамин Е), увеличение концентрации холестерина и усиление его отложение в аорте (селен), индукция опухоли печени (дегидроэпиандростерон).
Применение радиопротекторов в дозах 10-5 ЛД50 не вызывает побочных эффектов.
Очевидно также, что есть возможности моделировать протекторы других рядов антиоксидантов с заранее заданными свойствами, которые были бы более доступны и n-уровни которых встраивались бы в середину запрещенной зоны [23].
Вывод
Таким образом, применение радиопротекторов, служащих для защиты от радиационного излучения, может оказаться перспективным для предохранения ДНК, РНК, белков, организма в целом от старения.
Для применения предлагается биологическая добавка, синтезированная на основе наиболее эффективных для защиты ДНК радиопротекторов.
Литература
1. Gregory J. Gatto,, Gregory J. Gatto, Michael T. Boyne, Neil L. Kelleher Biosynthesis of Pipecolic Acid by RapL, a Lysine Cyclodeaminase Encoded in the Rapamycin Gene Cluster // Journal of the American Chemical Society. - 2006-03-01. - Vol. 128, iss. 11. - P. 3838-3847. - DOI:10.1021/ja05876
2. Wouter De Haes, Lotte Frooninckx, Roel Van Assche, Arne Smolders, Geert Depuydt Metformin promotes lifespan through mitohormesis via the peroxiredoxin PRDX-2 (англ.) // Proceedings of the National Academy of Sciences. - 2014-06-17. - Vol. 111, iss. 24. - P. E2501-E2509. - ISSN 1091-6490. - DOI:10.1073/pnas.1321776111
3. Zhang, Y., Xie, Y., Berglund, E. D., et al,, & Mangelsdorf, D. J. (2012). The starvation hormone, fibroblast growth factor-21, extends lifespan in mice. Elife, 1. e00065 DOI: http://dx.doi.org/10.7554/eLife.00065
4. Ames B.N., Shigenaga M.K., Hogen T.M. Oxidants, antioxidants, and the degenerative diseases of aging // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.-1993.- Vol. 90.- P. 7915-7921.
5. Cutler R. Oxidative stress: its potential relevance to human disease and longevity determinants // Age.- 1995.- Vol. 18.- P. 91-96.
6. Harman D. Free-radical theory of aging: invreasing the functional life span // Ann. N.Y. Acad. Sci. - 1994. - Vol. 717. - P. 1-15.
7. Papa S., Skulachev V.P. Reactive oxygen species, mitochondria, apoptosis and aging // Molec. Cell. Biochem. - 1997. - Vol.174. - P. 305-319.
8. Orr W.C., Sohal R.S. Extension of life-span by overexpression of superoxide dismutase and catalase in Drosophila melanogaster // Science. - 1994. - Vol. 263. - P. 1128-1130.
9. Parkes T.L., Elia A.J., Dickinson D. et al. Extension of Drosophila lifespan by over-expression of human SOD1 in motoneurons // Nature Genetics. - 1998.- Vol. 19.- P. 171-174.
10. Vladimir P. Skulachev, Vladimir N. Anisimov, Yuri N. Antonenko, Lora E. Bakeeva, Boris V. Chernyak. An attempt to prevent senescence: A mitochondrial approach // Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. - 2009-05-01. - Т. 1787, вып. 5. - С. 437-461. - DOI:10.1016/j.bbabio.2008.12.008
13. Племенков В. В. Природные соединения селена и здоровье человека. // Вестник РГУ им. И. Канта. 2007. - Вып. 1. Естественные науки. - С. 63—68.
14. Юрова М. Н., Забежинский М. А., Пискунова Т. С., Тындык М. Л., Попович И. Г. Анисимов В. Н., Влияние митихондриального антиоксиданта SkQ1 на старение, продолжительность жизни и спонтанный канцерогенез у мышей трех линий. // Успехи геронтологии.. - 2010. - Т. 23. - №3. - С. 430-441.
15. Антоненко Ю. Н., Аветисян А. В., Бакеева Л. Е. и др. Производное пластохинона, адресованное в митохондрии, как средство. Прерывающее программу старения: катионные производные пластохинона: синтез и исследование in vitro. // Биохимия. 2008. - Т.73 - №12. - С. 1589-1606.
16. Tauskela J. S. MitoQ – a mitochondria-targeted antioxidant. // Drugs. – 2007. - Vol. 10. - №6 - P. 339-412.
17. Doughan A. K., Dikalov S. I. Mitochondrial redox cycling of mitoguinone leads to superoxide prodiction and cellular apoptosis. // Antioxid Redox Signal. – 2007. - Vol. 9(11). - P. 1825-1836.
18. Vijg J. DNA sequence changes in aging: How frequent, how important? // Aging. Clin. Exp. Res. - 1990. - Vol. 2. - P. 105-123.
19. Likhachev A.J. Effects of age on DNA repair in relation to carcinogenesis // Cancer and Aging / A. Macieira-Coelho, B. Nordenskjold, eds.-Boca Raton, FL: CRC Press. -, 1990. - P. 97-108.
20. Anisimov V.N. Carcinogenesis and Aging. //Boca Raton: CRC Press. - 1987. Vol. 1; 2. – P. 165; 148.